차세대 염기서열 분석 기술(Next Generation Sequencing, NGS)은 기존의 생어 시퀀싱(Sanger Sequencing)과 비교하여 동시에 대량의 데이터를 생산할 수 있는 것이 특징입니다. 기술의 발전으로 대량의 염기서열 데이터를 얻는데 필요한 비용이 점차 감소하고 있은, 분석 비용과 시간을 크게 줄일 수 있는 표적 시퀀싱(Target Sequencing) 기술은 여전히 각광받고 있습니다. 현재 널리 사용되는 표적 시퀀싱 기술은 다중 PCR(Multiplex PCR)과 액상 혼성화(Hybridization Capture) 기법 두 가지가 있습니다.
- 다중 PCR(Multiplex PCR)
Multiplex PCR은 한 PCR 반응 내에서 동시에 여러 개의 표적 위치를 증폭할 수 있도록 PCR 프라이머 쌍(Primer pairs)들을 조합하여 사용하는 방식입니다. PCR 증폭을 통한 표적 시퀀싱은 실험 과정이 매우 간편하고 빠르게 수행할 수 있다는 장점을 가지고 있습니다. 그러나 표적 위치의 서열 특성에 따라 편차가 발생하거나, 프라이머 결합 위치에 변이가 존재하는 경우 증폭이 불가능해질 수 있으며, 포함된 프라이머 쌍의 수가 많아질수록 원래의 조합이 아닌 다른 프라이머 간의 상호작용으로 인해 타겟하지 않은 영역이 증폭될 수 있어서 동시에 포획 가능한 영역의 크기가 제한될 수 있습니다. 또한, NGS 데이터의 형태가 프라이머 위치에 의해 고정되므로 데이터 분석 과정에서 PCR Duplicate를 구별하여 제거하는 것이 불가능합니다.
- 액상 혼성화(Hybridization Capture) 기법
액상 혼성화(Hybridization Capture)기법은 표적 영역에 상보적으로 결합할 수 있는 프로브(Probe)를 디자인하고, 프로브의 비오티(Biotin)에 결합하는 스트렙타비딘(Streptavidin)으로 코팅된 자석 비드를 이용하여, 프로브와 결합한 DNA 분자를 선별해내는 기술입니다. PCR을 이용한 표적 시퀀싱에 비해 실험이 복잡하다는 단점이 있으나, 프로브간의 상호 작용을 무시할 수 있어 포획 영역의 크기를 늘리는데 제한이 없으며, 프로브의 길이가 더 길기 때문에 변이가 존재하더라도 여전히 포획이 가능하다는 장점이 있습니다. 또한, NGS 데이터의 형태가 라이브러리 제작 과정에서 수행되는 임의의 파편화 과정에서 결정되므로 PCR Duplicate를 구분하는 것이 가능하여 데이터 분석의 정확도를 더 높일 수 있습니다.
다중 PCR과 액상 혼성화 기법을 이용한 NGS 데이터는 아래와 같이 서로 다른 패턴으로 나타납니다.
[요약]
표적 시퀀싱에 있어서 다중 PCR과 액상 혼성화 기법은 모두 유효한 기술이며, 서로 상보적인 특성을 가지고 있습니다. 다중 PCR은 표적 영역의 수가 적거나 크기가 작을 때 효율적으로 동작할 수 있으며, 액상 혼성활 기술은 다량의 유전자나 큰 영역을 분석하는데 더 효과적입니다. 어느 한 기술이 더 우월하기보다는 분석하고자 하는 영역의 크기나 샘플의 특성, 변이의 종류나 연구 목적에 따라 더 적합한 기술을 선택하는 것이 중요합니다.