극한의 샘플 컨디션을 넘어서: 저품질·초극소량 샘플에서 NGS 수율을 극대화하는 셀레믹스 솔루션
현실의 임상 샘플이 지닌 한계
차세대 염기서열 분석(NGS) 실험의 성공을 결정짓는 가장 중요한 요소 중 하나는 고품질의 DNA/RNA 샘플을 확보하는 것입니다. 하지만 실제 연구 및 임상 현장에서 마주하는 샘플은 오랜 기간 보관되어 심하게 분해된 FFPE 조직이나, 혈액 속에 극미량으로 존재하는 ctDNA 등 열악한 컨디션인 경우가 많습니다.
이러한 열악한 샘플 컨디션은 낮은 라이브러리 수율과 불균일한 시퀀싱 커버리지로 이어질 수 있습니다. 본 글에서는 셀레믹스의 Target Enrichment 및 Library Preparation 기술이 이러한 한계를 어떻게 보완하고, 신뢰할 수 있는 데이터를 확보할 수 있도록 지원하는지 실제 내부 검증 데이터를 통해 살펴봅니다.
1. 저품질 FFPE 샘플에서의 안정적인 라이브러리 구축
종양학 연구에서 FFPE 샘플은 필수적이지만, 포르말린 고정 과정에서 발생하는 DNA의 교차결합과 심한 분해는 Target Capture 효율을 크게 저하시킬 수 있습니다. FFPE 샘플 분석의 성공 여부는 Target Capture 이전의 Library Preparation 단계에서부터 결정됩니다.
- Celemics Solution
셀레믹스 LP Kit는 DIN 값이 낮고 품질이 현저히 저하된 FFPE 샘플에서도 효율적이고 안정적인 라이브러리를 구축할 수 있도록 최적화되어 있습니다.
이렇게 준비된 라이브러리는 셀레믹스의 독자적인 Probe Design 기술 및 Hybridization Buffer System과 결합되어, 심하게 짧아진 DNA fragment까지 효과적이고 특이적으로 capture할 수 있도록 지원합니다.
[Performance Data]DIN 값이 매우 낮은 FFPE 임상 샘플 11개를 사용하여 Library Preparation을 수행했습니다. I사 Kit를 사용한 경우 샘플 전반에서 Adapter Dimer peak와 upper region의 bubble-like artifact peak가 다수 관찰되었으며, 일부 샘플에서는 라이브러리가 정상적으로 생성되지 않았습니다.
반면 셀레믹스 Library Prep Kit는 FFPE 샘플의 품질 차이에 따른 라이브러리 편차가 존재할 수 있음에도 불구하고, I사 대비 높은 라이브러리 제작 효율과 안정성을 확인했습니다.
| Company I Library Prep Kit | Celemics Library Prep Kit |
|---|---|
 |
 |
* 해당 FFPE 임상 샘플의 DIN score는 1.4–2.2로, highly degraded DNA 조건에서 Library Preparation을 수행했습니다.
2. FFPE DNA 샘플의 대량 Multiplexing 안정성 검증
저품질 샘플을 이용해 대량의 시퀀싱을 수행할 때는 비용과 운영 효율을 고려하여 여러 샘플을 하나의 run으로 구성하는 Multiplexing이 활용됩니다. 그러나 샘플의 품질이 낮은 경우 샘플 간 read 분포나 데이터 품질의 불균형이 발생할 수 있습니다.
- Celemics Solution & Data
OncoSpan FFPE(Horizon Discovery) 샘플과 셀레믹스 CancerScreen Comprehensive – DNA Panel을 이용해 실험을 수행했습니다.
샘플을 개별적으로 처리한 Single-plex FFPE Sample 조건과 8개 샘플을 함께 처리한 8-plex FFPE Sample 조건을 비교 분석했습니다.
- Results
Single-plex와 8-plex 조건에서 각각 84.72%와 84.53%의 On-target Read Ratio를 확인했습니다.
Coverage uniformity를 나타내는 Uniformity(St.Dev) 역시 Single-plex에서 0.56, 8-plex에서 0.57로 유사하게 유지되었습니다.
이 결과는 Library 구성 조건과 pooling 환경이 달라지더라도 높은 On-target 성능과 일관된 데이터 uniformity를 유지할 수 있음을 보여줍니다.
| Sample Info. | On-target Read Ratio | Uniformity (St.Dev) |
|---|---|---|
| Single-plex FFPE Sample | 84.72% | 0.56 |
| 8-plex FFPE Sample | 84.53% | 0.57 |
3. 분절/손상된 FFPE RNA 샘플에서의 Fusion 정밀 검출
RNA는 DNA보다 화학적 구조가 불안정하여 FFPE 샘플 내에서 분해 속도가 훨씬 빠릅니다. 이 때문에 FFPE RNA 샘플에서 암 진단의 주요 마커인 융합 유전자(Structural Variation/Fusion)를 정확히 잡아내는 것은 NGS 분석 중 꽤 까다로운 작업에 속합니다.
- Celemics Solution & Data
셀레믹스는 CancerScreen Comprehensive – RNA 패널을 통해 이 한계를 극복했습니다. Seraseq® FFPE Fusion RNA Reference Material v4에 포함된 somatic cancer 관련 RNA variant fusion point를 사용하여 검출 성능을 시험했습니다. - Results
IGV 플롯 분석 및 STAR-Fusion 파이프라인 확인 결과, LMNA-NTRK1 재배열(Rearrangement) 영역에서 성공적인 캡처 및 데이터 생성이 이루어졌음을 확인했습니다. 이는 분해도가 높은 FFPE RNA 환경에서도 노이즈를 제어하여 정밀한 검출이 가능함을 보여주는 결과입니다.
4. 극소량 ctDNA 샘플에서의 미세 변이 검출
액체 생검(Liquid Biopsy)에서 ctDNA를 분석하는 것은 거대한 모래사장에서 바늘을 찾는 것과 같습니다. 투입되는 샘플의 양 자체가 극히 적을 뿐만 아니라, 변이 대립유전자 빈도(VAF)가 1% 미만인 경우가 많아 극도로 높은 민감도와 정확도가 요구됩니다.
- Celemics Solution & Data
셀레믹스는 극소량의 샘플 투입량에서도 타겟 영역의 시퀀싱 깊이를 안정적으로 확보하기 위해 UMI(Unique Molecular Identifier, 분자 바코드) 기술을 적용합니다. UMI 기술은 각각의 DNA 분자에 고유한 식별자를 부여하여, 데이터 분석 시 PCR 중복을 최소화하고 증폭 과정에서 발생하는 오류를 완벽하게 걸러냅니다. 이를 통해 캡처 균일도와 정확도를 극대화함으로써 노이즈 없이 선명한 데이터를 도출합니다.
- Results
Seraseq® ctDNA Reference Material v2(AF 1%, AF 0.5%)와 Mutation Mix v2 WT를 사용하여 셀레믹스 ctDNA Panel의 검출 성능을 평가했습니다.
평가에 사용된 Panel은 다음과 같습니다.
– Colorectal Cancer Panel: 15개 유전자
– Breast Cancer Panel: 27개 유전자
– Lung Cancer Panel: 28개 유전자 marker
시험 결과, 모든 암종 Panel에서 Allele Frequency 0.5% 및 1.0% 변이에 대해 94% 이상의 분석적 민감도(Sensitivity)와 96% 이상의 특이도(Specificity)를 확인했습니다.
결론: Challenging Sample을 위한 End-to-End NGS Workflow
저품질 FFPE DNA, 분해된 FFPE RNA, 초극소량 ctDNA와 같이 분석이 어려운 샘플에서는 단순히 sequencing depth를 높이는 것만으로 원하는 결과를 확보하기 어려울 수 있습니다.
초기 Library Preparation 단계의 안정성부터 Multiplexing 환경에서의 uniformity, Fusion capture, UMI 기반 error correction에 이르기까지 각 단계가 전체 분석 성능에 영향을 미칩니다.
셀레믹스의 End-to-End Target Enrichment Workflow는 Library Preparation, Probe Design, Hybridization Capture 및 UMI 기반 분석을 통합하여, 열악한 샘플 조건에서도 일관되고 분석 가능한 genomic data를 확보할 수 있도록 지원합니다.
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