차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing, NGS), 특히 Illumina, MGI와 같은 플랫폼을 사용하는 short-read NGS는 일반적으로 DNA library의 양 말단에 시퀀싱 장비에 맞는 어댑터 서열을 붙여야합니다. 이로 인해, 모든 샘플들은 양 말단에 동일한 서열을 가지게됩니다.
이러한 동일한 서열은 라이브러리(Library) 제작 과정에서 Bubble product라는 부산물이 발생하는 원인이 됩니다. 이는 다양한 실험 및 시퀀싱 문제를 초래합니다. 이번 게시글에서는 이러한 버블(Bubble Product)이 어떻게 형성되고, 타겟 캡처 실험과 시퀀싱에 어떤 영향을 미치는지 설명합니다.
1.버블 형성과 DNA 라이브러리 패턴 변화(Bubble Formation and Changes in DNA Library Patterns)
버블(Bubbles)은 라이브러리(Library)의 모든 DNA 조각이 같은 양 말단의 어댑터 서열을 가지고 있고 PCR Primer가 많이 소모되었을 때 발생합니다. 프라이머(Primer)의 양이 줄어들면서 어댑터 부분에 프라이머(Primer)가 결합(Binding)하는 대신 서로 다른 조각에서 온 두 가닥의 DNA가 서로 접합(annealing)되는 것입니다.
이러한 Bubble은 일반적으로 다음 두 가지 조건에 크게 영향을 받습니다.
- Input DNA의 양
- PCR의 Cycle 수
또한, 버블(Bubble)의 형성은 DNA의 품질(quality)에도 영향을 받을 수 있어서 안정적인 실험 조건을 설정하는 변수로 작용하곤 합니다.
일반적으로 절단된 DNA를 이용하는 library prep kit보다 Genomic DNA와 같이 크기가 큰 DNA 를 자르면서 동시에 End-repair, A-tailing 하는 Enzamatic preparation kit(EP Kit)에서 더 쉽게 Bubble이 발생할 수 있습니다. EP Kit의 경우 자르는 시간이 길어질 수록 DNA 조각의 숫자가 늘어날 수 있기 때문입니다.
이러한 버블(Bubble)이 발생하기 시작하면 아래 그림의 1번부터 3번 순서와 같이 Target DNA의 band가 점점 줄어들면서 Bubble band가 커지고, 그 이후에는 4번 그림과 같이 크기와 농도가 매우 부정확해지는 단계로 확장되기도 합니다. (Figure 2-4).
2. 버블의 영향(Impact of Bubbles)
버블(Bubbles)은 DNA 라이브러리(Library)의 정확한 농도와 크기를 파악하기 어렵게 만듭니다. 특히, 라이브러리 준비(Library Preparation) 후 바로 시퀀싱을 수행해야 하는 경우, 정확한 농도와 크기 파악이 어려워 데이터 생산 시 쏠림 현상이 발생할 수 있습니다.
또한, Target Enrichment와 같은 후속 실험 시, 샘플 멀티플렉싱(Sample Multiplexing)을 진행할 경우 샘플 간 섞이는 비율 차이가 커질 수 있어서 실험 결과에 쏠림 현상이 발생할 수 있습니다.
3. 버블의 예방(Preventing Bubbles)
셀레믹스는 그 동안의 연구를 통해 라이브러리 준비 절차에서 버블 형성을 유발할 수 있는 주요 요인을 다음과 같이 확인했습니다.
- Input DNA의 양
- DNA fragmentation time (enzymatic library preparation kit의 경우)
- Pre-PCR cycle 조절
- Post-PCR cycle 조절
셀레믹스는 자사 Library Preparation Kit와 Target Enrichment Kit를 사용하는 고객이 실험에서 버블 형성을 방지하기 위한 최적 조건을 찾을 수 있도록 도움을 드리고 있습니다. 최적의 실험 조건에서 성공적인 결과를 얻기 위해 셀레믹스로 문의하시기 바랍니다.